Об исследованиях в самой «горячей» области современной микробиологии, которые позволят бороться с нежелательными бактериями, «Газете.Ru» рассказал Константин Северинов, заведующий лабораториями Института молекулярной генетики РАН и Института биологии гена РАН, профессор Университета Ратгерса (США).
— С чем связан интерес к изучению процессов иммунитета у бактерий?
— Наша планета — планета бактерий и их вирусов, бактериофагов (в переводе с греческого «пожирателей бактерий»). По современным оценкам,
количество бактерий на Земле около 1028 клеток, а количество бактериофагов порядка 1030 штук.
Это огромные числа, на много порядков превосходящие количество всех многоклеточных организмов, когда-либо существовавших на планете. Несмотря на то что количество бактериофагов существенно превышает количество бактерий, количество жертв (бактерий) и паразитов (бактериофагов) в целом остается неизменным. Происходит это потому, что бактерии используют целый ряд механизмов для ограничения или полного предотвращения заражения бактериофагами. Бактериофаги, в свою очередь, постоянно ищут способы преодоления такой устойчивости. Эта эволюционная «гонка вооружений» в планетарном масштабе никогда не прекращается; результатом ее является более-менее устойчивое равновесие и огромное разнообразие механизмов устойчивости бактерий к бактериофагам и, наоборот, способов, с помощью которых бактериофаги преодолевают защитные механизмы бактерий.

— В чем принципиальное отличие «бактериального иммунитета» от традиционных систем борьбы с вирусами?
— Одним из распространенных механизмов устойчивости к бактериофагам являются бактериальные системы рестрикции-модификации. Изучение этих систем в конце 60-х годов прошлого века привело к развитию методов молекулярного клонирования и во многом обусловило быстрое развитие современных наук о жизни и биотехнологической промышленности. Совсем недавно была обнаружена еще одна универсальная система, с помощью которой бактерии борются с бактериофагами. Называется эта система CRISPR. Удивительным свойством CRISPR-систем является то, что они действуют строго по ламарковскому принципу, обеспечивая адаптивный наследуемый иммунитет бактерий к бактериофагам.
200 лет назад Ламарк предположил, что окружающая среда определяет форму и организацию животных, а приобретенные под влиянием среды признаки (адаптации) наследуются.
Дарвин предложил другой механизм возникновения биологического разнообразия, который в двадцатом веке стал общепринятым, если не считать отдельные фриковские «выбросы» вроде лысенковщины. Оказалось, что CRISPR-системы ламарковские, адаптивные, а не дарвиновские. Во время заражения некоторые бактерии выживают из-за того, что короткие фрагменты ДНК бактериофага (длиной 30 пар нуклеотидов) встраиваются в специальный CRISPR-участок (локус) бактериальной хромосомы. Клетки, в которых произошло такое встраивание, становятся устойчивыми к повторному заражению бактериофагом. Происходит это потому, что, при условии полного соответствия последовательностей ДНК CRISPR-локуса и ДНК бактериофага, последняя уничтожается.
«Ламарковость» CRISPR-систем заключается в том, что устойчивость первоначально может возникнуть только во время заражения (т. е. при изменении условий окружающей среды), но при этом наследуема, так как все потомки клетки, которая встроила фрагмент ДНК бактериофага в CRISPR-локус, остаются устойчивыми к заражению.
 


У некоторых современных бактерий CRISPR-локусы содержат сотни встроенных фрагментов ДНК различных бактериофагов, что обеспечивает очень широкий спектр множественной устойчивости. Бактериофаги «обходят» устойчивость, вызванную CRISPR-системами, меняя последовательность своего генома. Даже единичной мутации, нарушающей полное соответствие между ДНК бактериофага и ДНК из CRISPR-локуса, достаточно для того, чтобы сделать клетку чувствительной к заражению.
— Существуют ли аналогичные механизмы адаптации у более сложных — многоклеточных — организмов?
— CRISPR-системы функционируют посредством малых РНК, то есть являются некоторым подобием системы интерференции РНК, за открытие которой в 2006 году Эндрю Файер и Крейг Мелло получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Явление РНК-интерференции состоит в том, что активность многих генов может быть «погашена» в присутствии малых молекул РНК (длиной 20–30 нуклеотидов), последовательность которых совпадает с участками последовательности этих генов.
До сих пор считалось, что РНК-интерференция — это явление, характерное лишь для высших организмов, чьи клетки содержат ядро.
Наша работа, опубликованная в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, и работа наших коллег показывают, что механизм, с помощью которого СRISPR-РНК находит мишень в геноме бактериофага, поразительно схож с механизмом, с помощью которого малые РНК интерферируют (т. е. выключают) гены высших организмов. Таким образом, СRISPR-системы формально аналогичны системам РНК-интерференции. Они аналогичны, как крылья бабочки, птицы и летучей мыши — признаки, независимо отобранные под влиянием среды, которая поставила перед организмами определенную задачу.
Исследования CRISPR-систем — самая «горячая» область современной микробиологии.
Сейчас даже странно думать, что пять-шесть лет назад об этих системах почти ничего не было известно, у них даже не было названия.
— Чем определяется высокая эффективность работы CRISPR-систем?
— В нашей работе и в работе наших коллег из Беркли, которая будет опубликована одновременно с нашей статьей, исследуется вопрос о том, как обеспечивается точное и эффективное узнавание последовательностей-мишеней в ДНК бактериофагов CRISPR-системами. Проблема здесь следующая: как на молекулярном уровне убедиться в том, что все 30 нуклеотидов CRISPR-РНК точно соответствуют последовательности мишени в ДНК бактериофага? Ведь на каждый случай строгого соответствия будет приходиться большое количество частичного соответствия (совпадение 29 из 30 нуклеотидов, 28, 27 и т. д.).
Перебор всех не вполне «правильных» ситуаций требует времени, а поиск последовательности-мишени должен быть очень быстрым, иначе бактериофаг начнет размножаться — и клетка неминуемо погибнет.

Оказалось, что природа решила эту проблему очень естественным и элегантным способом, «разложив» сравниваемые последовательности из 30 нуклеотидов на фрагменты и проверяя наличие полного соответствия на таких коротких фрагментах. При этом проверка соответствия происходит по иерархическому принципу, т. е. если нет точного соответствия на первом, самом главном фрагменте, который мы назвали seed sequence, то дальнейшей проверки не происходит, а начинается поиск новой последовательности-мишени.
— Есть ли прикладные аспекты у обнаруженного механизма адаптивного иммунитета?
— Изучение действия CRISPR-систем — очень интересная фундаментальная биологическая проблема, но, пользуясь полученными данными, можно добиться результатов в практической борьбе с нежелательными бактериями. Например,
изменив специфичность узнавания последовательности-мишени, можно пытаться вызвать «аутоиммунную» реакцию — заставить бактерий уничтожить самих себя.
Другим примером является молочная промышленность, где заражение бактериофагами приводит к миллиардным убыткам при производстве сыров и других кисломолочных продуктов. Специалисты датской фирмы Danisco, которые несколько лет назад впервые описали защитную функцию CRISPR-систем, в этом году вывели на европейских рынок новый бренд молочных продуктов CRISPEX, которые получены с помощью лактобактерий, устойчивых ко всем известным бактериофагам за счет специально отобранных CRISPR-локусов.
— Вы участвовали в первой волне конкурса «мегагрантов», но не вошли в число победителей. Планируете ли вы участвовать во второй волне конкурса?
— Да, я буду участвовать. Как и в прошлом году, мы подаем заявку с центром нанобиотехнологии Санкт-Петербургского государственного политехнического университета. Сама заявка изменится очень мало, в основном за счет описания новых результатов, полученных со времени подачи заявки на первую волну конкурса. Связано это с тем, что,
судя по результатам прошлогодней экспертизы, нам просто нечего улучшать, так как и российские, и международные эксперты единодушно сошлись на том, что наша заявка самого высокого уровня, а проект, направленный на изучение эволюции, экологии и экспрессии генов бактериофагов бактерий, обитающих в термальных источниках, «обречен» на успех.
Критики там просто не было. Так что проиграли мы по причинам, не связанным с научной экспертизой.
— Университет согласился с вами работать, несмотря на прошлогодний негативный опыт?
— Да, согласился. В СПбГПУ недавно сменился ректор. Я встречался с новым ректором — профессором А. И. Рудским, и он полностью поддерживает нашу заявку. Тем более что наше сотрудничество с Политехом долгосрочное и будет развиваться вне зависимости от того, получим мы этот грант или нет. В наших планах совместная научная работа с использованием уникального парка приборов центра нанобиотехнологий, особенно лазерной ловушки, которая позволяет изучать процесс транскрипции ДНК на уровне отдельных молекул, а также создание ЦКП и учебного центра – возможно, с привлечением ресурса Сколково и создаваемого в Петербурге фармкластера.